Agrobacterium-mediated insertional mutagenesis of the ochratoxigenic fungus Aspergillus westerdijkiae

Author： Mata Marcia M Taniwaki Marta H Iamanaka Beatriz T Sartori Daniele Oliveira André L.M Furlaneto Márcia C Fungaro Maria Helena P.

Publisher： NRC Research Press

ISSN： 1480-3275

Source： Canadian Journal of Microbiology, Vol.53, Iss.1, 2007-01, pp. : 148-151

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Abstract

Aspergillus westerdijkiae is a potent ochratoxin A (OTA) producer that has been found in coffee beans. OTA is known to have nephrotoxic effects and carcinogenic potential in animal species. Here we report for the first time the Agrobacterium-mediated transformation for Aspergillus westerdijkiae and the generation of ochratoxin-defective mutants. Conidia were transformed to hygromycin B resistance using strain AGL-1 of Agrobacterium tumefaciens. The obtained transformation frequency was up to 47 transformants per 10⁶ target conidia. Among 600 transformants, approximately 5% showed morphological variations. Eight transformants with consistently reduced OTA production were obtained. Two of these transformants did not produce OTA (detection limit: 0.1 μg/kg); the other six mutants produced lower amounts of OTA (1%–32%) compared with the wild-type strain. By using thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction, we successfully identified a putative flavin adenine dinucleotide monooxygenase gene.Key words: Aspergillus ochraceus, Aspergillus westerdijkiae, Agrobacterium-mediated transformation, Agrobacterium-mediated insertional mutagenesis, ochratoxin A.Aspergillus westerdijkiae est un producteur important d'ochratoxine A (OTA) qui a été trouvé dans les fèves de café. L'OTA est reconnue pour ses effets néphrotoxiques et son potentiel cancérigène chez les espèces animales. Nous rapportons ici pour la première fois la transformation d'Aspergillus westerdijkiae par l'intermédiaire d'Agrobacterium et la génération de mutants défectifs en ochratoxine. Les conidies ont été transformées avec la souche AGL-1 d'Agrobacterium tumefaciens conférant la résistance à l'hygromycine B. La fréquence de transformation obtenue allait jusqu'à 47 transformants par million de conidies cibles. Parmi les 600 transformants obtenus, environ 5 % présentaient des variations morphologiques. Huit transformants dont la production d'OTA était régulièrement réduite ont été obtenus. Deux d'entre eux ne produisaient pas d'OTA (limite de détection : 0,1 µg/kg) tandis que les six autres mutants produisaient de plus faibles quantités d'OTA (1 % – 32 %) comparativement à la souche sauvage. En utilisant un PCR à asymétrique thermique entrelacée, nous avons pu identifier un gène potentiel d'une FAD monooxygénase.Mots clés : Aspergillus ochraceus, Aspergillus westerdijkiae, transformation via Agrobacterium, mutagenèse d'insertion via Agrobacterium, ochratoxine A.[Traduit par la Rédaction]