Getting the most out of fluorescent amplified fragment length polymorphism

Author： Trybush Sviatlana Hanley Steven Cho Kang-Hyun Jahodová Šárka Grimmer Michael Emelianov Igor Bayon Carlos Karp Angela

Publisher： NRC Research Press

ISSN： 1480-3305

Source： Canadian Journal of Botony, Vol.84, Iss.8, 2006-08, pp. : 1347-1354

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Abstract

Amplified fragment length polymorphism (AFLP™) is one of the most widely applied molecular marker detection systems used today. Among the reasons for its popularity are its reproducibility, capacity to generate large numbers of data points in a single assay, and “off-the-shelf” universal applicability. The original AFLP protocol was developed using radioactive detection. The transfer of this technique to fluorescent detection on automated DNA fragment analysers not only removed the undesirable requirement for radioactivity but also provided the possibility for increased effectiveness and detection throughput. Unfortunately, a number of problems are frequently encountered with fluorescent AFLPs, particularly failure to amplify high molecular-weight fragments and generation of nonuniform peak distributions. Here, we describe an improved generic protocol for fluorescent AFLPs achieved mainly thorough optimization of the multiplexed selective amplification reaction. This improved protocol gives increased production of valuable high molecular-weight markers and uniform peak intensities, facilitating unambiguous scoring. The protocol has been successfully applied, without further optimization, to species of Salix and Populus (Salicaceae), Melampsora (Melampsoraceae, rust fungi) and Heracleum (Apiaceae), as well as sugar beet (Beta vulgaris L. subsp. vulgaris, Amaranthaceae), the endangered species Ranunculus kadzunensis Makino (Ranunculaceae), and to Aphidius ervi Haliday (Braconidae), a parasitoid wasp.Le polymorphisme de la longueur des fragments amplifiés (AFLP™) est un des systèmes les plus utilisés actuellement, pour la détection des marqueurs moléculaires. Parmi les raisons qui expliquent cette popularité, on retrouve la reproductibilité, la capacité de produire de grands nombres de données dans un seul essai et son applicabilité universelle «off-the-shelf». Le protocole AFLP original a été développé en utilisant la détection par radioactivité. Le transfert de cette technique à la détection par fluorescence sur des analyseurs de fragments d’ADN automatisés n’a pas seulement éliminé les contraintes indésirables de la radioactivité, mais offre également la possibilité d’augmenter l’efficacité et la détection en continue. Malheureusement, on rencontre souvent un nombre de problèmes avec les AFLPs fluorescents, surtout l’incapacité d’amplifier les fragments de haut poids moléculaires, et la génération de pic de distributions non-uniformes. On décrit ici un protocole générique amélioré, pour les AFLPs fluorescents, réalisé surtout par l’optimisation de la réaction multiplex sélective d’amplification. Ce protocole amélioré augmente la production de marqueurs utiles de forts poids moléculaires et donne des intensités de pics uniformes, ce qui facilite la notation. On a appliqué le protocole avec succès, sans autre optimisation, à des espèces de Salix et Populus (Salicaceae), Melampsora (Melampsoraceae, champignons de la rouille) et Heracleum (Apiaceae), ainsi qu’à la betterave à sucre (Beta vulgaris subsp. vulgaris, Amaranthaceae), et les espèces menacées Ranunculus kadzunensis Makino (Ranunculaceae) et Aphidius ervi (Braconideae), une guêpe parasite.