Hydrogen peroxide affects abscisic acid binding to ABAP1 in barley aleurones

ISSN： 1208-6002

Source： Biochemistry and Cell Biology, Vol.85, Iss.5, 2007-10, pp. : 628-637

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Abstract

Dramatic increases in H₂O₂ levels have been observed following abscisic acid (ABA) treatment of plant tissues. Following ABA treatment in aleurone cells, H₂O₂ reached transient levels of approximately 115μmol/L H₂O_2. To determine whether ABA perception was modified by such changes, the effect of H₂O₂ on a recently characterized ABA-binding protein (ABAP1), cloned from barley aleurone layers, was examined. ABA binding to the protein was weakened by H₂O₂ in a concentration-dependent manner. A concentration of 75μmol/L H₂O₂ gave a 50% decline in ABA binding in a reaction following first-order kinetics, indicative of binding-site susceptibility to its microenvironment. We monitored the unfolding of ABAP1 using steady-state and time-resolved tryptophan fluorescence, while following the capacity of ABAP1 to bind ABA. ABA binding decreased by 50% following ABAP1 denaturation with 1mol/L guanidine hydrochloride or 2mol/L urea, while the maximum emission spectra (λ_emi) red shifted from 338 to 347nm at 3.5mol/L guanidine hydrochloride and 5mol/L urea. However, only a slight blue shift of λ_emi was observed following either ABAP1 incubation with H₂O₂ or binding to (+)-ABA (physiologically active ABA). The equilibrium ABA dissociation rate accelerated in the presence of 250μmol/L H₂O₂, with the half-time dissociation reduced to 8min. A comparison of inactivation kinetics and conformational changes shows that inactivation of ABAP1 occurs before any noticeable conformational change. This suggests that the ABA binding site is highly responsive to its microenvironment and is situated in a region that is more flexible than the protein molecule as a whole. The results demonstrate that H₂O₂, generated by ABA treatment of aleurone layers, is sufficient to affect the ABA-binding capacity of ABAP1, suggesting that this may be another level of control of ABA signal transduction.Une augmentation importante des niveaux de H₂O₂ a été observée chez des tissus végétaux traités à l’acide abscissique (ABA). Suite à un traitement de cellules à aleurone avec l’ABA, le H₂O₂ atteignait une concentration transitoire d’approximativement 115 μmol/L. Afin de déterminer si la perception de l’ABA était modifiée par ces changements, nous avons étudié l’effet du H₂O₂ sur une protéine liant l’ABA (ABAP1) récemment caractérisée, clonée des cellules à aleurone de l’orge. Une concentration de 75 μmol/L de H₂O₂ induisait une diminution de 50% de la liaison d’ABA selon une réaction suivant une cinétique de premier ordre, indice de la susceptibilité du site de liaison à son microenvironnement. Nous avons examiné le dépliement de l’ABAP1 par fluorescence du tryptophane à l’équilibre et en résolution temporelle pendant que nous suivions la capacité de liaison de l’ABAP1 à l’ABA. La liaison de l’ABA diminuait de 50% après la dénaturation de l’ABAP1 par 1 mol/L de GuHCl ou par 2 mol/L d’urée, alors que le spectre d’émission maximal (λ_emi) passait dans le rouge de 338 à 347 nm avec 3.5 mol/L de GuHCl et 5 mol/L d’urée. Cependant, seul un faible décalage dans le bleu du λ_emi était observé après une incubation de l’ABAP1 avec du H₂O₂ ou en présence ou en absence d’ABA. Le taux de dissociation à l’équilibre de l’ABA était accéléré en présence de 250 μmol/L de H₂O₂, le demi-temps de dissociation étant réduit à 8 min. La comparaison des cinétiques d’inactivation et des changements de conformation montre que l’inactivation de l’ABAP1 se produit avant tout changement de conformation notable. Ceci suggère que le site de liaison de l’ABA est hautement sensible à son microenvironnement et qu’il est situé dans une région plus flexible que la protéine en son entier. Les résultats démontrent que le H₂O₂ produit par un traitement des cellules à aleurone avec l’ABA est suffisant pour affecter la capacité de liaison de l’ABAP1 à l’ABA, suggérant que ceci puisse constituer un autre niveau de contrôle de la transduction de signaux de l’ABA.