Analysis of recombinant tagged equilibrative nucleoside transporter 1 (ENT1) expressed in E. coli

Author: Reyes German   Nivillac Nicole M.I.   Chalsev Maria   Coe Imogen R.  

Publisher: NRC Research Press

ISSN: 1208-6002

Source: Biochemistry and Cell Biology, Vol.89, Iss.2, 2011-04, pp. : 246-255

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Abstract

Nucleoside transporters (NTs) are integral membrane proteins necessary for the cellular entry of nucleoside analog drugs used in chemotherapeutic treatment of conditions such as cancer and viral or parasitic infections. NTs are also the targets of certain drugs used in the treatment of various cardiovascular conditions. Because of the importance of NTs in drug uptake, determination of the three-dimensional structure of these proteins, particularly hENT1, has the potential to improve these treatments through structure-based design of more specifically targeted and transported drugs. In this paper, we use NMR spectroscopy to investigate the structure of the large intracellular loop between transmembrane domains 6 and 7 and we also describe a method for the successful overexpression of full-length hENT1 in a bacterial system. Recombinant tandem histidine-affinity (HAT) and 3×FLAG tagged hENT1 was overexpressed in E. coli, affinity purified, and functionally characterized by nitrobenzylthioinosine (NBTI) binding. Anti-3×FLAG immunodetection confirmed the expression of N-HAT-3×FLAG-hENT1, while increased NBTI binding (3.2-fold compared with controls) confirmed the conformational integrity of the recombinant hENT1 within the bacterial inner membrane. Yields of recombinant hENT1 using this approach were ~15 µg/L of bacterial culture and this approach provides a basis for large-scale production of protein for a variety of purposes.Les transporteurs de nucléosides (TN) consistent en protéines membranaires intégrales nécessaires à l’entrée dans les cellules d’analogues des nucléosides utilisés en chimiothérapie pour traiter des maladies ou des situations comme le cancer ou les infections virales/parasitaires. Les TN sont aussi les cibles de certains médicaments utilisés dans le traitement de certaines maladies cardiovasculaires. À cause de l’importance des TN dans la capture de médicaments, la détermination de la structure tridimensionnelle de ces protéines, particulièrement hENT1, pourrait permettre d’améliorer ces traitements par la conception, d’après cette structure, de médicaments ciblés et transportés de manière plus spécifique. Dans cet article, nous utilisons la spectroscopie RMN afin d’examiner la structure de la grande boucle intracellulaire située entre les domaines 6 et 7, et nous décrivons aussi une méthode efficace de surexpression de hENT1 de pleine longueur dans un système bactérien. Un transporteur hENT1 recombinant portant des étiquettes d’affinité d’histidine en tandem (HAT) et 3×FLAG a été surexprimé chez E. coli, purifié par affinité et caractérisé fonctionnellement par la liaison de nitrobenzylthioionsine (NBTI). La détection immunologique à l’aide d’un anti-3×FLAG a confirmé l’expression de N-HAT-3×FLAG-hENT1, alors que l’augmentation de la liaison de NBTI (3,2 fois comparativement au contrôle) a confirmé l’intégrité conformationnelle du hENT1 recombinant au sein de la membrane interne bactérienne. La récolte de hENT1 recombinant était d’environ 15 µg/L de culture bactérienne en utilisant cette approche, celle-ci constituant une base à partir de laquelle la production à grande échelle de la protéine sera envisagée à différentes fins.

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